Funktion und Effizienz von amber-Suppressor-tRNAs in der zellfreien Proteinbiosynthese

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, Wege aufzuzeigen, die die gezielte Einführung unnatürlicher Ami­nosäuren in Proteine mit der Methodik des Ein­satzes chemisch aminoacylierter amber-Suppressor-tRNAs verbessern. Um die besonderen Bedingungen beim Einsatz von amber-Suppressor-tRNAs in der zellfreien Proteinbiosynthese zu beleuchten, wurden sowohl in vivo exprimierte als auch in vitro transkribierte amber-Suppres­sor-tRNAs auf unterschiedlichen Funktionsebenen innerhalb eines Escherichia coli in vitro-Translationssystems charakterisiert. Letztendlich ermöglichten die Untersuchungen eine Einstufung der Suppressionseffizienz von sieben verschiedenen in vitro transkribierten amber-Suppressor-tRNA-Spezies. Die zielgerichtete Insertion einer unnatürlichen Aminosäure in ein Protein konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit an­hand der Insertion von ?-Dansyl- Lysin in FABP demonstriert werden. Nicht unerwartet war der Einbau der unnatürlichen Aminosäure äußerst ineffizient. Als eine weitere Limitation der dem Einbau unnatürlicher Aminosäuren zugrunde liegenden Methodik erwies sich die Aufreinigung größerer Mengen an homogenen in vitro transkri­bierten verkürzten tRNAs, die für die Herstellung der mit der unnatürlichen Aminosäure beladenen tRNA eine unabdingbare Voraussetzung ist. Die Aufreinigung homogener tRNAs war aufgrund der starken 3'-Endheterogenität der Transkriptionsprodukte äußerst problematisch. Sowohl die Homogenität der tRNA als auch die absolute Ausbeute ließen sich deutlich verbessern, indem die normalerweise für die Transkription mit T7-RNA-Polymerase gebräuchliche Temperatur von 37°C auf ein Optimum von 44°C erhöht wurde. Zudem zeigten unterschiedliche Präparationen von T7-RNA-Polymerase verschieden starke n+1-Aktivitäten. Zur Untersuchung der Aktivitäten in vivo exprimierter amber-Suppressor-tRNAs, wurden Gesamt-tRNA-Präparationen aus insgesamt 10 verschiedenen, bei Kleina et al. (1990) beschrie­benen Escherichia coli-amber-Suppressor-Zellstämmen in der in vitro-Translation einge­setzt. Die Relationen in den Suppressionsaktivitäten der amber-Suppressor-tRNAs für Leucin, Histidin, Tyrosin und Serin entsprachen denen in vivo. Die geringere Suppressionsaktivität anderer unter­suchter amber-Suppressor-tRNAs in vitro gibt möglicherweise einen Hinweis darauf, daß die Aktivität einiger Aminoacyl- tRNA-Synthetasen im in vitro Translationssystem reduziert ist. Prozessierung, Reparatur und Aminoacylierung in vitro transkribierter tRNAs und ihre Bezie­hung untereinander wurden eingehend untersucht. Homogene tRNA- Präparationen mit korrek­tem CCA-Ende konnten durch eine Prozessierung oder durch die Regeneration des 3'-Endes der in vitro transkribierten tRNAs in der S100-Enzymfraktion des Translationssystems erhalten wer­den. Die Prozessierung verlän­gerter tRNAs und die Reparatur verkürzter tRNAs innerhalb des Gesamtsystems erwiesen sich als nicht limitierend für die Proteinbiosynthese. Letztendlich konnte die unterschiedliche Suppressionsaktivität der Transkripte von sieben amber-Suppressor-tRNA-Spezies (tRNASerCUA {su+1}, tRNATyrCUA {su+3}, tRNALeuCUA {su+6}, tRNALeu5CUA, tRNAPheCUA, tRNAHisCUA und tRNAAla1CUA) auf strukturelle Eigenschaften der entsprechenden Amino­acyl- tRNAs zurückgeführt werden. Als Maß für die Suppressions­effizienz diente die Häufig­keit der ribosomalen tRNA-Selektion im Vergleich zur Häufigkeit der Selektion von RF1. Alle untersuchten amber-Suppressor-tRNAs enthielten die als ideal für die Suppression beschriebene Nukleotidfolge 5'C34U35A36A37A383' innerhalb ihrer Anticodonschlaufe. Auch in Anwesenheit dieser Sequenz unterschieden sich die Suppressionseffizienzen der einzelnen amber-Suppressor- tRNAs sehr stark. Die Rate der tRNA-Selektion des stärksten Suppressors, tRNASerCUA, war über 20 mal so hoch wie die Rate der tRNA-Selektion für tRNAAla1CUA, die die Suppressions­effizienz der zur Zeit für die Einführung unna­türlicher Aminosäuren verwendeten amber-Suppressor-tRNAs repräsentiert. Generell war die Suppressionseffizienz um so besser, je mehr die Sequenz der ursprünglichen Wildtyp-tRNA der Sequenz der aus ihr abgeleiteten amber- Suppressor-tRNA ähnelte. Mit zunehmender Anzahl der Mutationen, die nötig waren, die Sequenz 5'C34U35A36A37A383' in­nerhalb der Anticodon-Schlaufe zu erhalten, nahm die Suppressionseffizienz der tRNAs ab. Insofern unterstützen die Ergebnisse die Theorie des "Extended Anticodon" (Yarus 1982). Die beiden mit Abstand besten Suppressoren tRNASerCUA und tRNATyrCUA ent­halten die Base C32 innerhalb der Anticodon-Schlaufe. Wichtige Strukturelemente für die Suppression liegen möglicherweise auch außerhalb des Anticodon-Armes. Es ergaben sich Hinweise darauf, daß eine TypII-Struktur der tRNA die Suppression begünstigt. Die im Rahmen der Biotechnologie bedeutendste Konsequenz aus der vorliegenden Arbeit ist, daß die zur Zeit für die Einführung unnatürlicher Aminosäuren in Proteine verwendeten amber-Suppres­sor-tRNAs relativ schwache amber- Suppressoren sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sollte die Konstruktion wesentlich verbesserter amber-Suppressoren und damit eine sehr viel effizientere Insertion unnatürlicher Aminosäuren in Proteine möglich sein. [if !supportEmptyParas] [endif]