Evaluation of cutaneous and circulating (serum and exosomes) levels of chemokines (CCL17, CCL22, CCL27 and CCL28) in atopic dogs and their correlation with severity of the disease

Canine atopic dermatitis (AD) is a complex multifactorial disease characterised by an exaggerated immunological response. Little is known about the role that cutaneous and circulating chemokines play in disease severity.To evaluate the messenger (m)RNA and protein levels of selected chemokines in skin and serum of healthy and atopic dogs, and in the atopic group to determine whether there is a correlation with disease severity.Skin biopsies and blood samples were taken from 12 privately owned atopic [lesional (AD-L) and nonlesional (AD-NL) skin] and 12 privately owned healthy dogs. Circulating exosomes were extracted from the serum. Cutaneous and exosomal mRNA levels of CCL17, CCL22, CCL27 and CCL28 were quantified using quantitative real-time PCR. Protein levels were evaluated using canine-specific ELISA kits. The severity and extent of the clinical signs also were assessed in the atopic dogs using Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index, 4th iteration (CADESI-04) and a validated pruritus Visual Analog Scale (pVAS).The expression of CCL28 exosomes in skin was greater in AD-L when compared to healthy (P = 0.019) and AD-NL (P = 0.002) samples. However, serum expression was lower in dogs with AD compared to healthy dogs (P = 0.03). A higher expression of CCL17 and CCL22 was seen in AD-L when compared to healthy skin (P = 0.018 and P = 0.019, respectively). There also was a positive correlation between clinical scores and CCL22 (AD-NL; r = 0.6, P = 0.05) and between the pruritus score and CCL22 (AD-L; r = 0.6, P = 0.05). Differences in CCL27 concentrations were not observed.This study suggests that CCL17, CCL22 and CCL28 may play a role in the cutaneous inflammatory response in atopic dogs. They may be considered as markers of disease severity, although further studies are needed to validate these findings.La dermatite atopique canine (DA) est une maladie multifactorielle complexe caractérisée par une réponse immunologique exagérée. On sait peu de choses sur le rôle des chimiokines cutanées et circulantes dans la gravité de la maladie.Évaluer les niveaux d'ARNm (messager) et de protéines de chimiokines sélectionnées dans la peau et le sérum de chiens sains et atopiques, et dans le groupe atopique afin de déterminer s'il existe une corrélation avec la gravité de la maladie. MATÉRIELS ET MÉTHODES: Des biopsies cutanées et des échantillons de sang ont été prélevés sur 12 chiens atopiques [peau lésionnelle (AD-L) et non lésionnelle (AD-NL)] et 12 chiens sains de propriétaires privés. Les exosomes circulants ont été extraits du sérum. Les niveaux d'ARNm cutanés et exosomaux de CCL17, CCL22, CCL27 et CCL28 ont été quantifiés à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel. Les niveaux de protéines ont été évalués à l'aide de kits ELISA spécifiques canins. La gravité et l'étendue des signes cliniques ont également été évaluées chez les chiens atopiques à l'aide de l'indice d'étendue et de gravité de la dermatite atopique canine, 4e itération (CADESI-04) et d'une échelle visuelle analogue de prurit validée (pVAS). RÉSULTATS: L'expression des exosomes CCL28 dans la peau était supérieure dans AD-L par rapport aux échantillons sains (P = 0,019) et AD-NL (P = 0,002). Cependant, l'expression sérique était plus faible chez les chiens atteints de MA par rapport aux chiens sains (P = 0,03). Une expression plus élevée de CCL17 et CCL22 a été observée dans AD-L par rapport à la peau saine (respectivement P = 0,018 et P = 0,019). Il y avait également une corrélation positive entre les scores cliniques et CCL22 (AD-NL ; r = 0,6, P = 0,05) et entre le score de prurit et CCL22 (AD-L ; r = 0,6, P = 0,05). Aucune différence dans les concentrations de CCL27 n'a été observée.Cette étude suggère que CCL17, CCL22 et CCL28 pourraient jouer un rôle dans la réponse inflammatoire cutanée chez les chiens atopiques. Ils peuvent être considérés comme des marqueurs de la gravité de la maladie, bien que d'autres études soient nécessaires pour valider ces résultats.INTRODUCCIÓN: La dermatitis atópica canina (AA) es una enfermedad multifactorial compleja caracterizada por una respuesta inmunológica exagerada. Poco se sabe sobre el papel que juegan las quimioquinas cutáneas y circulantes en la severidad de la enfermedad. OBJETIVO: evaluar los niveles de proteína y RNA mensajero (mRNA) de quimioquinas seleccionadas en la piel y el suero de perros sanos y atópicos, y en el grupo atópico para determinar si existe una correlación con la gravedad de la enfermedad. MATERIALES Y MÉTODOS: se tomaron biopsias de piel y muestras de sangre de 12 perros atópicos de propietarios particulares [piel lesionada (AD-L) y no lesionada (AD-NL)] y 12 perros sanos también de particulares. Los exosomas circulantes se extrajeron del suero. Los niveles cutáneos y exosómicos de RNAm de CCL17, CCL22, CCL27 y CCL28 se cuantificaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de proteína se evaluaron utilizando kits ELISA específicos para caninos. La gravedad y el alcance de los signos clínicos también se evaluaron en los perros atópicos utilizando el índice de extensión y gravedad de la dermatitis atópica canina, cuarta revisión (CADESI-04) y una escala análoga visual de prurito validada (pVAS). RESULTADOS: la expresión de exosomas de CCL28 en la piel fue mayor en AD-L en comparación con muestras sanas (P = 0,019) y AD-NL (P = 0,002). Sin embargo, la expresión sérica fue menor en perros con DA en comparación con perros sanos (P = 0,03). Se observó una mayor expresión de CCL17 y CCL22 en AD-L en comparación con la piel sana (P = 0,018 y P = 0,019, respectivamente). También hubo una correlación positiva entre las puntuaciones clínicas y CCL22 (AD-NL; r = 0,6, P = 0,05) y entre la puntuación de prurito y CCL22 (AD-L; r = 0,6, P = 0,05). No se observaron diferencias en las concentraciones de CCL27. CONCLUSIONES E IMPORTANCIA CLÍNICA: este estudio sugiere que CCL17, CCL22 y CCL28 pueden desempeñar un papel en la respuesta inflamatoria cutánea en perros atópicos. Pueden considerarse como marcadores de la gravedad de la enfermedad, aunque se necesitan más estudios para validar estos hallazgos.Die atopische Dermatitis des Hundes (AD) ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung, die durch eine übertriebene Immunantwort charakterisiert wird. Es ist wenig bekannt über die Rolle, die kutane und zirkulierende Chemokine beim Schweregrad der Erkrankung spielen. ZIEL: Eine Evaluierung der Messenger (m) RNA und der Proteinwerte von selektierten Chemokinen in der Haut und im Serum von gesunden und atopischen Hunden, sowie eine Untersuchung, ob in der atopischen Gruppe eine Korrelation mit dem Schweregrad der Erkrankung besteht.Hautbiopsien und Blutproben wurden von 12 privaten atopischen Hunden [(Läsionale (AD-L) und nichtläsionale (AD-NL) Haut] und 12 privaten gesunden Hunden genommen. Es wurden zirkulierende Exosome aus dem Serum extrahiert. Kutane und exosomale mRNA Werte von CCL17, CCL22, CCL27 und CCL28 wurden mittels quantitativer real-time PCR quantifiziert. Proteinwerte wurden mittels Hunde-spezifischer ELISA Kits evaluiert. Der Schweregrad und das Ausmaß der klinischen Zeichen wurden bei den atopischen Hunden ebenfalls mittels Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index, 4te Auflage (CADESI-04) und einer validierten Juckreiz Visual Analog Scale (pVAS) beurteilt.Die Exprimierung von CCL28 Exosomen in der Haut war bei AD-L größer im Vergleich zu gesunden (P = 0,019) und AD-NL (P = 0,002) Proben. Nichtsdestotrotz war die Exprimierung im Serum bei Hunden mit AD im Vergleich zu gesunden Hunden (P = 0,03) niedriger. Eine höhere Exprimierung von CCL17 und CCL22 wurde bei AD-L im Vergleich zu gesunder Haut (P = 0,018 bzw P = 0,019) gefunden. Es bestand auch eine positive Korrelation zwischen klinischen Werten und CCL22 (AD-NL; r = 0,6; P = 0,05) und zwischen den Juckreizwerten und CCL22 (AD-L; r = 0,6; P = 0,05). Es wurden keine Unterschiede bei den CCL27 Konzentrationen beobachtet.Diese Studie liefert Hinweise, dass CCL17, CCL22 und CCL28 eine Rolle bei der Entzündungsantwort der Haut atopischer Hunde spielen könnte. Sie könnten als Marker für den Schweregrad der Erkrankung betrachtet werden, obwohl noch weitere Studien nötig sind, um diese Ergebnisse zu validieren.要約 背景: 犬アトピー性皮膚炎(AD)は、免疫反応の亢進を特徴とする多因子複合疾患である。皮膚および血中ケモカインが疾患の重症化に果たす役割については、ほとんど知られていない。 目的: 本研究の目的は、健常犬とアトピー犬の皮膚および血清中の選択したケモカインのメッセンジャー(m)RNAおよびタンパク質レベルを評価し、アトピーグループにおいては、疾患の重症度と相関があるかどうかを判断することであった。 材料と方法: アトピー[病変皮膚(AD-L)および非病変皮膚(AD-NL)]のオーナー所有犬12頭と健常オーナー所有犬12頭から皮膚生検および血液サンプルを採取した。血清から循環エクソソームを抽出した。CCL17、CCL22、CCL27、CCL28の皮膚およびエクソソームmRNAレベルは、定量的リアルタイムPCRを用いて定量化した。タンパク質レベルは、犬特異的ELISAキットを用いて評価した。臨床症状の重症度および程度も、犬アトピー性皮膚炎重症度指数(CADESI-04)および有効なかゆみのVisual Analog Scale(pVAS)を用いて評価された。 結果: 皮膚におけるCCL28エクソソームの発現は、健常(P = 0.019)およびAD-NL(P = 0.002)サンプルと比較して、AD-Lでより大きかった。しかし、血清中の発現は、健常犬と比較してAD犬で低かった(P = 0.03)。健常皮膚と比較した場合、AD-LではCCL17とCCL22の高い発現が見られた(それぞれP = 0.018とP = 0.019)。また、臨床スコアとCCL22(AD-NL；r=0.6、P=0.05)およびそう痒スコアとCCL22(AD-L；r=0.6、P=0.05)の間に正の相関が見られた。CCL27濃度の差は観察されなかった。 結論と臨床的重要性: 本研究は、CCL17、CCL22およびCCL28がアトピー犬の皮膚炎症反応に関与している可能性を示唆するものである。これらの所見を検証するためにさらなる研究が必要であるが、これらは疾患の重症度マーカーとして考えられるかもしれない。.摘要 背景: 犬特应性皮炎(AD)是一种复杂的多因素疾病，表现为过度的免疫应答。我们对皮肤和循环趋化因子在疾病严重程度中的作用知之甚少。 目的: 评价健康和特应性犬皮肤和血清中选定趋化因子的信使(m)RNA和蛋白水平，并在特应性组中确定是否与疾病严重程度存在相关性。 材料和方法: 从12只私家特应性犬[病变(AD-L)和非病变(AD-NL)皮肤]和12只私家健康犬中采集皮肤活检和血液样本。从血清中提取循环外泌体。使用定量实时PCR定量CCL17、CCL22、CCL27和CCL28的皮肤和外泌体mRNA水平。使用犬特异性ELISA试剂盒评价蛋白水平。还使用犬特应性皮炎程度和严重指数第4版(CADESI-04)和经验证的瘙痒视觉模拟量表(pVAS)评估特应性皮炎犬中临床体征的严重程度和范围。 结果: 与健康(P = 0.019)和AD-NL(P = 0.002)样本相比，AD-L皮肤中CCL28外泌体的表达更高。然而，与健康犬相比，AD犬的血清表达较低(P = 0.03)。与健康皮肤相比，在AD-L中观察到CCL17和CCL22的较高表达(分别为P = 0.018和P = 0.019)。临床评分与CCL22(AD-NL；r = 0.6，P = 0.05)、瘙痒评分与CCL22(AD-L；r = 0.6，P = 0.05)也呈正相关。未观察到CCL27浓度的差异。 结论和临床重要性: 本研究表明CCL17、CCL22和CCL28可能在特应性犬的皮肤炎症反应中发挥作用。它们可被认为是疾病严重程度的标志物，尽管还需要进一步的研究来验证这些发现。.Resumo CONTEXTO: A dermatite atópica canina (DA) é uma doença multifatorial complexa caracterizada por uma resposta imunológica exagerada. Pouco se sabe sobre o papel das quimiocinas cutâneas e circulantes na gravidade da doença. OBJETIVO: Avaliar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) e de proteínas de quimiocinas selecionadas na pele e soro de cães saudáveis e atópicos, e, no grupo atópico, determinar se há correlação com a gravidade da doença. MATERIAIS E MÉTODOS: Biópsias cutâneas e amostras de sangue foram coletadas de doze cães atópicos de proprietários [pele lesional (DA-L) e não lesional (DA-N)] e doze cães saudáveis de proprietários. Exossomos circulantes foram extraídos do soro. Os níveis cutâneos e exossômicos de mRNA de CCL17, CCL22, CCL27 e CCL28 foram quantificados utilizando o PCR real-time quantitativo. Os níveis de proteínas foram avaliados utilizando kits de ELISA específico canino. A gravidade e a extensão dos sinais clínicos foram também avaliadas nos cães atópicos utilizando o Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index, 4th iteration (CADESI-04) e a escala visual analógica de prurido validada (pVAS). RESULTADOS: A expressão dos exossomos de CCL28 na pele foi maior em DA-L quando comparado a amostras de cães saudáveis (P=0,019) e de DA-NL (P=0,002). No entanto, a expressão sérica foi menor em cães com DA em comparação com cães saudáveis (P=0,03). Observou-se expressão mais alta de CCL17 e CCL22 em DA-L quando comparada à pele saudável (P=0,018 e P=0,019, respectivamente). Também houve uma correlação positiva entre os escores clínicos e CCL22 (DA-NL; r=0,6, P=0,05) e entre o escore de prurido e CCL22 (DA-L; r=0,6, P=0,05). Não foram observadas diferenças nas concentrações de CCL27. CONCLUSÃO E IMPORTÂNCIA CLÍNICA: Este estudo sugere que CCL17, CCL22 e CCL28 participam da resposta inflamatória cutânea em cães atópicos. Elas podem ser consideradas marcadores de gravidade da doença, apesar de ainda serem necessários mais estudos para validar estes achados.