Βιοχημική και μοριακή ανάλυση της β-τύπου αφυδατάσης των δικαρβονικών στο φυτό Arabidopsis thaliana

Η καρβονική ανυδράση (EC: 4.2.1.1) αποτελεί ένα από τα πλέον διαδεδομένα ένζυμα, που καταλύει την αλληλομετατροπή CΟ₂ και HCΟ₃⁻. Απαντά σε οργανισμούς και των τριών κλάδων της εξέλιξης, στους οποίους εμφανίζεται με τη μορφή πέντε τουλάχιστον τύπων, των α-, β-, γ-, δ και ζ. Τα ένζυμα των πέντε αυτών κατηγοριών δεν παρουσιάζουν ομολογία μεταξύ τους, γεγονός που υποστηρίζει την ανεξάρτητη εξελικτική τους πορεία. Ωστόσο, χαρακτηρίζονται από έναν κοινό μηχανισμό κατάλυσης, με το ενεργό του κέντρο να διαμορφώνεται από ένα σύμπλοκο μετάλλου, κυρίως ψευδαργύρου. Τα ένζυμα της κάθε κατηγορίας συνδέονται, σε γενικές γραμμές, με συγκεκριμένη ομάδα οργανισμών. Παρόλα αυτά υπάρχουν και περιπτώσεις, όπως τα φυτά, που διαθέτουν περισσότερους του ενός τύπους των καρβονικών ανυδρασών. Στο Arabidopsis thaliana, ένα C3 φυτικό μοντέλο, η in silico ανάλυση είχε ως αποτέλεσμα την αναγνώριση δεκαεννέα γενετικών τόπων, οι οποίοι κωδικοποιούν, πιθανώς, για καρβονικές ανυδράσες των τριών πρώτων τύπων. Ειδικότερα, έξι από αυτούς αντιπροσωπεύουν β-τύπου ισοένζυμα, χαρακτηριστικά, άλλωστε, των φυτικών οργανισμών. Το γεγονός ότι και οι έξι αυτοί γενετικοί τόποι αντιπροσωπεύονται στις βάσεις δεδομένων από EST, υποδεικνύει τη δυνατότητα έκφρασής τους σε μεταγραφικό επίπεδο. Τα κωδικοποιούμενα πολυπεπτίδια παρουσιάζουν υψηλή ομολογία μεταξύ τους, η οποία ελαττώνεται μόνο στο 5’ και 3’ άκρο τους. Μεταξύ αυτών, τρία φαίνεται πως δραστηριοποιούνται στο κυτταρόπλασμα, δύο κατευθύνονται στους χλωροπλάστες και ένα έχει μιτοχονδριακή τοπολογία. Η RT-PCR ανάλυση με τη χρήση εξειδικευμένων εκκινητών αποκάλυψε την παρουσία μεταγραφημάτων των έξι γενετικών τόπων σε όλα τα επιμέρους όργανα του Arabidopsis, γεγονός που, μεταξύ άλλων, συνηγορεί υπέρ της δυνατότητάς τους να μεταγράφονται σε mRNA. Ωστόσο, τα διαφοροποιημένα πρότυπα έκφρασης, που παρουσιάζουν, αποτελούν ενδεχομένως ένδειξη των διακριτών ρόλων που επιτελούν στον φυτικό αυτό οργανισμό. Η καρβονική ανυδράση εμπλέκεται σε πλήθος φυσιολογικών διαδικασιών των ευκαρυωτών, όπως η αναπνοή, η φωτοαναπνοή, η νεογλυκογένεση, η λιπογένεση και η φωτοσύνθεση, με διαφορετικούς, σε κάποιες περιπτώσεις, βιοχημικούς ρόλους στα C3 και C4 φυτά. Στα πρώτα, δραστηριοποιείται, κυρίως, στους χλωροπλάστες των φύλλων όπου συμβάλλει στη διατήρηση της παροχής CΟ₂ στο βασικό ένζυμο της φωτοσύνθεσης των C3 φυτών, τη Rubisco. Στα C4 φυτά, το μεγαλύτερο μέρος της βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων του μεσοφύλλου. Στην περίπτωση αυτή συμβάλλει στον εφοδιασμό της PEPC με το κατάλληλο για τη δράση της υπόστρωμα, δηλαδή τα HCΟ₃⁻, καθιστώντας αποτελεσματικότερη τη δέσμευση του CΟ₂ από την ατμόσφαιρα και τον εγκλωβισμό του στο εσωτερικό των φύλλων. Επιπλέον, πρόσφατα αναφέρθηκε η δράση της καρβονικής ανυδράσης στο lumen των θυλακοειδών ανώτερων φυτών η οποία φαίνεται ότι συνδέεται με τη λειτουργία του φωτοσυστήματος II. Ωστόσο, εκτός από την εμπλοκή του στη φωτοσύνθεση, το ένζυμο αυτό φαίνεται ότι επιτελεί και ρόλους ανεξάρτητους της παραπάνω διαδικασίας. Ένας από αυτούς σχετίζεται με τον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων τόσο κατά τη διαδικασία της λιπογένεσης στα αναπτυσσόμενα έμβρυα όσο και κατά τη διακίνηση των ανθρακικών τους αποθεμάτων. Ο ρόλος αυτός εξυπηρετεί την εδραίωση των νεαρών εκφύτων κατά το λεγόμενο «μεταβατικό στάδιο» από την ετερότροφη ανάπτυξη στον φωτοαυτότροφο μεταβολισμό. Άλλοι πιθανοί ρόλοι σχετίζονται με διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα σε μέρη του κυττάρου πέρα από τους χλωροπλάστες, όπως το κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια. Στην πρώτη περίπτωση οι καρβονικές ανυδράσες εμπλέκονται, κυρίως, στη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των δύο ανόργανων μορφών άνθρακα ενώ στη δεύτερη με την ανακύκλωσή τους για τον εφοδιασμό και την αποτελεσματικότερη αφομοίωση του CΟ₂ στους χλωροπλάστες. Αξιοποιώντας το πλήθος των βιβλιογραφικών αναφορών που σχετίζονται με τις β- καρβονικές ανυδράσες, διερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο τους στο φυτό Arabidopsis thaliana. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκε αρχικά η χωροταξική κατανομή μεταγραφήμάτων των έξι βAtca γονιδίων μέσω του in situ RNA-RNA υβριδισμού σε εγκάρσιες τομές βλαστών, χεδρώπων και ανθέων. Η επιλογή φυτικών οργάνων με διαφορετική φωτοσυνθετική ικανότητα στόχευε στη διερεύνηση της εμπλοκής των εν λόγω ενζύμων τόσο σε φωτοσυνθετικές όσο και, πιθανά, σε μεταβολικές διαδικασίες των φυτών. Η παραπάνω μελέτη αποκάλυψε, σε γενικές γραμμές, αλληλοεπικαλυπτόμενα χωροταξικά πρότυπα έκφρασης των έξι γονιδίων, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί σε πιθανή συνεργιστική δράση των β-καρβονικών ανυδρασών στο Arabidopsis.. Επιπλέον, μελετήθηκε η in vitro λειτουργικότητα της μιτοχονδριακής βAtCA4 μέσω ετερόλογης έκφρασής της σε βακτηριακό σύστημα Escherichia coli. Η βAtCA4 είναι η μόνη από τα έξι β-τύπου ισοένζυμα στο Arabidopsis η οποία δεν φαίνεται να συμπληρώνει λειτουργικά μεταλλαγμένο στέλεχος της ζύμης Saccharomyces cerevisiae, ως προς τις β-καρβονικές ανυδράσες, υπό αερόβιες συνθήκες. Μετά την έκφρασή της στο παραπάνω ετερόλογο βακτηριακό σύστημα η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη απομονώθηκε με χρωματογραφία χημικής συγγένειας και ελέγχθηκε λειτουργικά με μετρήσεις ενζυμικής δραστικότητας μέσω φωτομετρικού προσδιορισμού. Οι δοκιμές δραστικότητας πραγματοποιήθηκαν έναντι υποστρώματος NaHCΟ₃ απ’ όπου διαπιστώθηκε η ικανότητα της ανασυνδυασμένης βAtCA4 να δεσμεύει δικαρβονικά ιόντα. Η ανάλυση της κινητικής του ενζύμου έναντι διάφορων συγκεντρώσεων του παραπάνω υποστρώματος αποκάλυψε ότι αυτή ακολουθεί το μοντέλο των Michaelis-Menten. Από τον προσδιορισμό της κινητικής σταθεράς Km και του λόγου kcat/Km προέκυψε ότι η ExAtCA4 επιδεικνύει μικρή συγγένεια και αποδοτικότητα έναντι των HCO₃⁻. Για τη διερεύνηση πιθανών φυσιολογικών ρόλων των β-καρβονικών ανυδρασών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια Atca1, Atca3, Atca4 και Atca5 χρησιμοποιήθηκαν ομόζυγες Τ-DNA μεταλλαγμένες σειρές. Αυτές εξετάστηκαν φαινοτυπικά και διαπιστώθηκε ο βαθμός κατά τον οποίο η μερική ή πλήρης απώλεια της δραστηριότητας καθενός από τα παραπάνω ένζυμα επηρεάζει τη μορφολογία των φυτών Arabidopsis. Εκτός από τις ομόζυγες μεταλλάξεις, μελετήθηκε και μια πιθανότατα μηδενική (null) μετάλλαξη του Atca3 γονιδίου, η οποία φαίνεται ότι παρουσιάζει θνησιγενή φαινότυπο με μορφολογικές και χρωματικές αλλοιώσεις σε έμβρυα και νεαρά φυτάρια. Οι αλλοιώσεις αυτές φαίνεται να διατηρούνται στα τέσσερα διαδοχικά γενετικά υπόβαθρα που μελετήθηκαν. Ωστόσο, τα ποσοστά τους εμφανίζονται διαφοροποιημένα μεταξύ των διαφόρων γενεών, γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενοι θνησιγενείς φαινότυποι αποτυπώνονται μόνο μερικώς στο γονιδίωμα των απογόνων της μετάλλαξης αυτής. Η ανάπτυξη ετερόζυγων μεταλλαγμένων φυτών σε θρεπτικά υποστρώματα διαφορετικής συγκέντρωσης σακχαρόζης και υπό συνθήκες χαμηλής έντασης φωτός δεν κατέστη δυνατό να αποκαταστήσει την επιβίωση των ομόζυγων φυτών. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει έναν πιθανώς μεταβολικό παρά φωτοσυνθετικό ρόλο του Atca3 γονιδίου κατά τα στάδια της εδραίωσης των νεαρών φυτών. Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των τεσσάρων παραπάνω καρβονικών ανυδρασών επιχειρήθηκε επαγωγή όσο το δυνατό εντονότερων φαινοτυπικών διαφοροποιήσεων μεταξύ αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων φυτών. Αυτό κατέστη δυνατό με την εφαρμογή περιβαλλοντικών συνθηκών καταπόνησης όπως η ώσμωση, η αλατότητα, οι φυτικές ορμόνες (ΑΒΑ και ΙΑΑ) και τα αντιβιοτικά (CHY). Ακολούθως, καταπονημένα και μη φυτά εξετάστηκαν ως προς τον φαινότυπο και τη μεταγραφική συμπεριφορά των τεσσάρων βAtca γονιδίων. Από τη σύνθεση των αποτελεσμάτων, που προέκυψαν, φαίνεται ότι τα εν λόγω ένζυμα εμπλέκονται σε ένα μεγάλο εύρος φυσιολογικών λειτουργιών του Arabidopsis και, ενδεχομένως, σε μηχανισμούς απόκρισης των φυτών σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι ρόλοι που αποδίδονται στα τέσσερα αυτά ισοένζυμα φαίνεται ότι σχετίζονται με τις εξειδικευμένες λειτουργίες που επιτελούν τα διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα στα οποία δραστηριοποιείται καθένα από αυτά.