基于吲哚胺2,3-双加氧酶1活性评价人间充质干细胞免疫调控功能的吸光光度法的建立及优化

目的建立一种基于吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1）的活性快速评价人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,h MSCs）免疫调控功能的吸光光度法,并进行优化。方法以含干扰素γ（interferonγ,IFNγ）的完全培养基激活hMSCs,收集hMSCs培养上清,与三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）和对二甲氨基苯甲醛（paradimethylaminobenzaldehyde,PDAB）反应,检测A492值,通过标准曲线计算样品中色氨酸代谢产物犬尿氨酸（kynurenine）的含量,以反映h MSCs所分泌IDO1的酶代谢活性,并对方法中的培养体系（6、12、24、48、96孔板）、IFNγ处理时间（4、8、12、24 h）、培养基使用量（150、200、250、300、350、400、450及500μl）及IFNγ作用浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、5.0及10.0 ng/ml）进行优化。同时验证方法的特异性,并检测样品保存条件及液氮冻存后不同复苏时间对kynurenine浓度的影响。采用优化后的方法分析不同来源、不同代次的hMSCs分泌IDO1的能力。结果确定最佳检测条件为：培养体系为48孔体系,IFNγ处理时间为24 h,培养基使用体积为200μl,IFNγ作用浓度为10.0 ng/ml。该方法可特异性检测IDO1的活性;除常温外,其他样品保存条件对检测结果影响较小;液氮冻存后复苏24 h可检测到与冻存前水平相当的kynurenine。该方法可有效判断不同供体来源的hMSCs在分泌IDO1功能上的差异。结论该方法可快速、特异、稳定地检测hMSCs分泌IDO1的水平,且操作简便,可用于快速评价h MSCs的免疫调控功能。