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CRISPR/Cas9‐based genome engineering in the filamentous fungus Rhizopus oryzae and its application to L‐lactic acid production

米根霉 基因组编辑 清脆的 Cas9 生物 基因 基因组 米曲霉 遗传学 计算生物学 生物化学 发酵
作者
Haodong Zhu,Han Wang,Li Wang,Zhiming Zheng
出处
期刊:Biotechnology Journal [Wiley]
卷期号:19 (9) 被引量:4
标识
DOI:10.1002/biot.202400309
摘要

Abstract The filamentous fungus Rhizopus oryzae is one of the main industrial strains for the production of a series of important chemicals such as ethanol, lactic acid, and fumaric acid. However, the lack of efficient gene editing tools suitable for R. oryzae makes it difficult to apply technical methods such as metabolic engineering regulation and synthetic biology modification. A CRISPR‐Cas9 system suitable for efficient genome editing in R. oryzae was developed. Firstly, four endogenous U6 promoters of R. oryzae were identified and screened with the highest transcriptional activity for application to sgRNA transcription. It was then determined that the U6 promoter mediated CRISPR/Cas9 system has the ability to efficiently edit the genome of R. oryzae through NHEJ and HDR‐mediated events. Furthermore, the newly constructed CRISPR‐Cas9 dual sgRNAs system can simultaneously disrupt or insert different fragments of the R. oryzae genome. Finally, this CRISPR‐Cas9 system was applied to the genome editing of R. oryzae by knocking out pyruvate carboxylase gene ( PYC ) and pyruvate decarboxylase gene ( pdcA ) and knocking in phosphofructokinase (pfkB) from Escherichia coli and L‐lactate dehydrogenase (L‐LDH) from Heyndrickxia coagulans , which resulted in a substantial increase in L‐LA production. In summary, this study showed that the CRISPR/Cas9‐based genome editing tool is efficient for manipulating genes in R. oryzae .
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